Mikrobiologi

Totalantalsbestämning

Totalantalsbestämning är en vanlig analys för läkemedel och medical device. För att analysera hur mycket mikroorganismer det finns i en icke-steril produkt utför vi totalantalsbestämning av bakterier och svamp enligt Ph Eur 2.6.12 / USP <61>. För kvantifiering av mikroorganismer utförs TAMC (Total Aerobic Microbial Count) och för kvantifiering av jäst och mögel utförs TYMC (Total Yeast and Mould Count).

Method Suitability Test (MST)

Innan rutinmässig analys av en produkt kan ske behöver en Method Suitability Test (MST) utföras för att säkerställa att metoden fungerar och att produkten inte kommer att hämma eventuella mikroorganismer i metoden.  En MST utförs som en initial test för varje produkt.  En MST utförs genom att produkten ympas med < 100 CFU av de mikroorganismer som beskrivs i Ph Eur 2.6.12 / USP <61> och dessa stammar ska sedan växa fram i metoden i närvaro av produkt.

Beroende på provets egenskaper används olika tekniker enligt Ph Eur / USP:

• Membranfiltrering: Går provet att filtrera är detta att föredra då det ger möjlighet att skölja bort eventuellt hämmande substanser. Provet filtreras genom ett 0,45 µm filter som håller tillbaka eventuella mikroorganismer vartefter filtret läggs på näringssubstrat för odling.
• Ingjutning: Om inte provet går att filtrera kan det gjutas in tillsammans med näringssubstrat för odling. Eventuellt hämmande effekt motverkas genom att späda provet innan ingjutning.
• Utstryk: Metoden har högre detektionsgräns än ingjutning och används främst till icke-filtrerbara produkter som inte har hämmande effekt på analysen.
• Rörspädning: Denna metod används då ingen av ovanstående metoder fungerar och man behöver späda bort hämmande effekter. Metoden är den minst känsliga.

Specifika mikroorganismer

Vi utför test för specifika mikroorganismer enligt Ph Eur 2.6.13 / USP <62>. Test för specifika mikroorganismer utförs med hjälp av selektiva odlingssubstrat. Testet är icke-kvantitativt och innebär att provet först anrikas i en näringslösning som gynnar allmän växt av mikroorganismer. Därefter görs ett utstryk av provberedningen på selektiv agar specifik för den enskilda mikroorganismen.

Method Suitability Test (MST)

Innan rutinmässig analys av en produkt kan ske behöver en Method Suitability Test (MST) utföras för att säkerställa att metoden fungerar och att produkten inte kommer att hämma eventuella mikroorganismer i metoden.  En MST utförs som en initial test för varje produkt.  En MST utförs genom att produkten ympas med < 100 CFU av de mikroorganismer som beskrivs i Ph Eur 2.6.13 / USP <62> och dessa stammar ska sedan växa fram i metoden i närvaro av produkt.

Beroende på produktens administrationsväg görs analys av olika specifika mikroorganismer, vilka som ska testas beskrivs i Ph Eur 5.1.4 och USP <1111>.

Vi utför test av följande specifika organismer: 

• Escherichia coli
• Salmonella
• Staphylococcus aureus
• Pseudomonas aeruginosa
• Clostridia
• Candida albicans
• Gallsaltstoleranta gramnegativa bakterier (Bile-tolerant Gram Negative bacteria)

Sterilkontroll

Vi utför sterilkontroll enligt Ph Eur 2.6.1 / USP <71> i LAF-bänk (klass A) i renrum klass B. Vid provsättningen utförs även negativ kontroll och hygienprovtagning av lokal, utrustning och personalens kläder för att säkerställa miljön i renrummet och dess eventuella påverkan på analysen.

Testet utförs på prover som genom aseptisk tillverkning eller slutsterilisering ska vara sterila, det kan vara läkemedel för injektion och vissa medicinsktekniska produkter. Ph Eur 2.6.1/USP <71> beskriver hur många enheter eller hur stor volym som ska ingå i kontrollen vilket beror på batchstorlek och volym per enhet.

En sterilkontroll utförs antingen genom membranfiltreringsmetod eller genom direktinokuleringsmetod. Provet fördelas enligt framtagen metod till två olika odlingsbuljonger, inkubering sker i minst 14 dagar följt av visuell kontroll för växt av mikroorganismer. TSB (Tryptic Soy Broth) för test av aeroba mikroorganismer inklusive svamp inkuberas i 20‑25 °C och Thio (Thioglycollate Broth) för test av både aeroba men även anaeroba mikroorganismer inkuberas i 30‑35 °C.

Method Suitability Test (MST)

Innan rutinmässig analys av en produkt kan ske behöver en Method Suitability Test (MST) utföras för att säkerställa att metoden fungerar och att produkten inte kommer att hämma eventuella mikroorganismer i metoden.  En MST utförs som en initial test för varje produkt.  En MST utförs genom att produkten ympas med < 100 CFU av de mikroorganismer som beskrivs i Ph Eur 2.6.1 / USP <71> och dessa stammar ska sedan växa fram i metoden i närvaro av produkt.

Endotoxinanalys

Endotoxinanalyser utförs för att detektera eller kvantifiera endotoxiner från gramnegativa bakterier. Vi utför Endotoxinanalyser enligt Ph Eur 2.6.14 och USP <85> med en metodkänslighet ned till 0,001 EU/ml.

Principen för en endotoxinanalys är detektion av en reaktion mellan endotoxinet från gramnegativa bakterier och Limulus lysat. Vi använder olika metoder som baserar sig antingen på mätning av turbidimetrisk (grumlighet) som effekt av gelbildning eller mätning av färgomslag (se även nedan). Analysen utförs med speciellt material och vatten för att utesluta falska positiva resultat. Parallellt med varje analys genereras en standardkurva och det utförs negativa kontroller.

Vi använder normalt följande tekniker:
Turbidimetrisk kinetisk metod:  Genom spektrofotometrisk bestämning av gelbildningen har metoden en känslighet på 0,01 EU/ml. Metoden lämpar sig bland annat för analys av färgade produkter och som kan tänkas störa den kromogena metoden, däremot lämpar den sig inte för produkter som i sig bidrar till en grumlighet av lösningen.

Kromogen kinetisk metod: Vår mest känsliga metod och det första kvantitativa testet som utvecklades. Beroende på vilken typ av lysat som används kan en känslighet på 0,005 eller 0,001 EU/ml uppnås. Metoden bygger på gul färgbildning från ett kromogent komplex vid reaktion mellan endotoxin och lysat. Färgbildningen mäts spektrofotometrisk och på grund av detta lämpar sig inte metoden för produkter som är starkt färgade. Produkter som är grumliga i lösning kan med fördel analyseras med denna metod.

Interfering Factors Test (IFT)

Innan rutinmässig analys av en ny produkt utförs en Interfering Factors Test (IFT) som initial kontroll för varje produkt.  En IFT verifierar vald analysmetod genom att påvisa eventuella hämmande eller förstärkande egenskaper hos produkten, och utförs genom att testa olika koncentrationer/spädningar av provet för att samtidigt kunna hålla detektionsgränsen lägre än eventuell specifikationsgräns, den såkallade Maximum Valid Dilution (MVD). Ph Eur 5.1.10 ”Guidelines for using the test for bacterial endotoxins” och USP <85> beskriver denna test. För nya produkter bör man utföra IFT på tre olika produktionsbatcher.